tulislah jawaban anda
1. Apa prinsip dasar dari ekstraksi DNA
Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah pemecahan dinding sel (cell lysis, cell disruption) bisa dengan detergen, buffer lisis (Tris-HCL dan SDS atau sodium dodecyle sulphate), pemisahan DNA dari bahan lain (debris, protein,selulosa), presipitasi DNA dan washing DNA pellet (dengan isopropanol atau alkohol dingin), produk DNA didapat kemudian disimpan pada suhu <-20ºC.
2. Apakah kamu dapat mengekstraksi dari bahan yang ada disekeliling kita ? Gimana caranya !
jawab :
Bisa, caranya
1. Sampel daun tanaman singkong yang terinfeksi jamur patogen, diambil dengan gunting steril (dibilas alkohol70%).
2. Sampel (1-2gram) digerus didalam mortal menggunakan pestle dan nitrogen cair.
3. Buffer ekstraksi CTAB 1 ml, ditambahkan ke dalam mortal dan digerus hingga homogen.
4. Sampel dipindahkan ke dalam 1,5ml mikrotub menggunakan pipet yang telah di potong ujungnya.
5. Inkubasi mikrotube ke dalam waterbath dengan suhu 65ºC selama 30 menit dengan setiap 10 menit dibolak-balik.
6. Sampel di inkubasi suhu ruang selama 10 menit.
7. Sebanyak 700µL CIA (cloroform:isoamyl alkohol 24:1) ditambahkan ke dalam sampel dan dibolak-balik secara perlahan-lahan agar tercampur merata.
8. Sampel di sentrifugasi dengan kecepatan 10.000-15.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit.
9. larutan DNA (berwarna bening bagian atas) akan memisah dengan larutan cloroform (berwarna hijau).
10. Fase atas (±650ml), dipindahkan kedalam mikrotub yang baru.
11. Tambahkan kloroform 1x volume supernatan (bolak-balik).
12. Sentrifugasi pada kecepatan 1000rpm, dan diambil supernatan bagian atas dan pindahkan ke mikrotub yang baru.
13. Tambahkan isopropanol dingin sebanyak 0,7x volume supernatan dan 0,1 volume Na-acetat (3M pH5) sehingga DNA mengendap.
14. Inkubasi 10 menit pada suhu ruang.
15. Sentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit.
16. Buang supernatan dan endapan pelet DNA dicuci dengan alkohol 70% sebanyak 700µL.
17. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000rpm selama 10 menit dan diulangi 1x.
18. Pelet dikering anginkan pada suhu ruang atau menggunakan vacum.
19. DNA dilarutkan dengan ddH2O atau TE buffer sebanyak 50-100µL.
20. DNA disimpan pada suhu <-20ºC
1. Apa prinsip dasar dari ekstraksi DNA
Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah menghancurkan
dinding dan membran sel , lalu mengeluarkan
DNA yang terdapat dalam nukleus tanpa menyebabkan
kerusakan pada DNA tersebut. metode ekstraksi dapat menggunakan kit komersial dan metode ekstraksi menggunakan
fenol-kloroform, bisa juga menggunakan deterjen, buffer lisis, sodium dodecyle sulphate. Tahapan proses ekstraksi DNA yaitu persiapan materi yang akan digunakan, proses
penghancuran sel, penghilangan senyawa kontaminan,
dan pengumpulan DNA. DNA yang diekstrak harus disimpan di suhu yang dingin serta terbebas dari
senyawa kontaminan seperti polisakarida, polifenol,
dan tanin yang seringkali ikut terbawa dan dapat
menghambat kerja beberapa enzim dalam kegiatan
molekuler.
2. Apakah kamu dapat mengekstraksi dari bahan yang ada disekeliling kita ? Gimana caranya !
jawab : bisa, misalkan kita ingin mengekstraksi DNA jamur. langkah-langkahnya adalah :
1. DNA jamur endofit diekstraksi dari kultur miselia menggunakan metode Wizard Genomic DNA Purification kit ex Promega Corp. (Madison, USA).
2. Miselia dikerik dan dimasukkan ke tabung mikro, dan ditambahkan EDTA 0,5 M (pH 8) dan enzim litikase. Selanjutnya inkubasi selama 60 menit (37°C), dan disentrifuga.
3. Endapannya ditambahkan pelisis inti sel (Nuclei lysis solution), dan larutan pengendap protein (Protein precipitation solution). 4. Sampel disentrifuga, dan supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke tabung mikro yang telah berisi isopropanol, dan disentrifuga kembali.
5. Setelah pelet DNA kering, etanol 70% juga ditambahkan.
6. Kemudian penambahan larutan rehidrasi DNA dan larutan RNase, dan diinkubasi.
7. Isolat
DNA yang didapatkan, disimpan dalam
lemari es pada suhu 2-8°C.