HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) merupakan metode analisis sampel yang kerap digunakan dalam industri maupun laboratorium analisis farmasi.
Untuk kamu yang baru mendengar istilahnya, artikel ini akan membantumu berkenalan dengan HPLC karena akan dibahas prinsip dasar HPLC serta bagian-bagian utamanya. Sedangkan untuk kamu yang sudah pernah belajar, tak ada salahnya mengingat-ingat kembali tentang metode kromatografi cair populer yang satu ini.
UltiMate™ 3000 RSLCnano System dari Thermo Scientific
Prinsip Dasar HPLC
Sesuai namanya, prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur sampel. Dalam kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi saat sampel bergerak melewati fase diam (dapat berupa zat padat atau cair) karena terbawa oleh fase gerak (dapat berupa zat cair atau gas).
Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap fase diam. Komponen yang dapat berinteraksi secara kuat dengan fase diam akan bergerak lebih lambat sehingga dapat terpisah dari komponen lain dengan interaksi yang lemah.
Kromatografi kertas
Pada kromatografi kertas, sampel yang diteteskan di bagian ujung kertas kromatografi (fase diam) akan lambat laun bergerak dan terpecah komponennya seiring dengan pergerakan cairan pada dasar kertas (fase gerak). HPLC pun demikian, sampel yang diinjeksikan bergerak melalui fase diam dalam kolom karena terbawa oleh fase gerak.
Apa yang membedakan HPLC dengan metode Kromatografi lainnya?
Sebagai salah satu metode kromatografi cair (liquid chromatography), HPLC menggunakan zat cair sebagai fase geraknya. Sampel yang telah dilarutkan dapat dipisahkan dan dihitung konsentrasi zat spesifik yang terkandung di dalamnya. Sebagai contoh, kandungan kafein dalam sampel minuman dapat diukur dengan HPLC berdasarkan afinitas kafein terhadap fase diam pada kolom yang digunakan.
Diagram di atas menunjukkan komponen utama yang terdapat pada HPLC. Larutan sampel diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh fase gerak (1) melewati fase diam pada kolom (5), kemudian hasilnya dibaca oleh detektor (6) dan ditampilkan pada pengolah data (7) sebagai kromatogram.
Berbeda dengan kromatografi kolom tradisional yang memanfaatkan gravitasi agar fase gerak dapat melalui fase diam, HPLC menggunakan pompa bertekanan tinggi (2) untuk mengalirkan fase gerak menuju kolom fase diam.
Kromatografi kolom
Fase diam yang digunakan dalam HPLC dapat terdiri dari partikel dengan pori berukuran mikron sehingga tekanan tinggi diperlukan agar fase gerak dan sampel dapat bergerak melewati pori tersebut. Penggunaan tekanan tinggi inilah menyebabkan metode ini dinamakan High Performance Liquid Chromatography atau yang dulu disebut juga sebagai High Pressure Liquid Chromatography.
Instrumentasi HPLC
Kalau kamu melihat lagi diagram HPLC di atas, HPLC terdiri atas beberapa komponen utama yang digunakan dalam analisis sampel. Berikut akan dibahas mengenai masing-masing komponen yang perlu kamu tahu.
1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut
Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi. Idealnya, pelarut khusus yang memang sudah memenuhi standard untuk HPLC dipergunakan untuk hasil yang lebih akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung.
Kiri: Methanol khusus HPLC ; Kanan: Reservoir yang terhubung ke pompa
2. Pompa
Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, pompa yang digunakan dalam HPLC haruslah pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom fase diam dan melewati detektor. Tekanan yang digunakan beragam tergantung dari dimensi kolom, ukuran partikel fase diam, serta laju alir dan komposisi dari fase gerak yang akan dipakai.
Pompa HPLC
3. Injektor
Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem injeksi otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam kisaran volume 0.1-100 mL.
Sistem injeksi otomatis
4. Sampel
Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat bening dan tidak ada endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan sebelum dianalisis, misalnya dengan melakukan filtrasi sampel. Preparasi lain dapat pula dilakukan sesuai kebutuhan seperti mengatur konsentrasi sampel, desalting, dan lain-lain.
5. Kolom HPLC
Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai fase diam. Di dalam kolom akan terjadi pemisahan komponen sampel yang kemudian dapat dihitung waktu retensi masing-masing komponennya oleh detektor. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju detektor. Waktu retensi dihitung dari saat sampel diinjeksikan hingga puncak pembacaan maksimum pada detektor. Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu yang berbeda sehingga masing-masing konsentrasinya dapat dihitung.
Kolom Silika dari Thermo Scientific
Kolom HPLC tersedia dalam panjang serta packing material yang berbeda-beda tergantung dari jenis HPLC yang hendak digunakan. Packing material merupakan material yang diisikan ke dalam kolom sebagai fase diam. Packing material yang sering digunakan biasanya yang berbasis silika, baik silika yang tidak dimodifikasi maupun yang telah termodifikasi seperti oktadesil silika (ODS) yang memiliki lapisan C18.
6. Detektor
Detektor UV-Vis
Alat ini berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang telah melewati kolom dan memberikan sinyal elektronik pada pengolah data. Terdapat beberapa jenis detektor HPLC tergantung dari karakteristik yang hendak dibaca. Misalnya pada detektor jenis UV-vis, maka karakteristik yang dibaca oleh detektor adalah absorbansinya. Detektor jenis lain yang bisa digunakan adalah detektor indeks bias, fluoresensi, serta detektor elektrokimia.
7. Pengolah Data
Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang terbaca oleh detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram menggambarkan jumlah komponen pada sampel dilihat dari jumlah puncak (peak) yang dihasilkan. Konsentrasi komponen yang hendak dianalisis dapat dihitung dengan membandingkan luas area peak komponen dengan luas area peak serta konsentrasi standar.
Contoh kromatogram
Nah, setelah kamu berkenalan dengan HPLC, sekarang kamu sudah bisa menjawab kalau ada temanmu yang bertanya mengenai prinsip HPLC. Jangan lupa yah, HPLC merupakan jenis kromatografi cair yang menggunakan zat cair sebagai fase geraknya, berbeda dengan GC yang menggunakan gas. Ciri khas HPLC yang membedakannya dari metode kromatografi lain adalah penggunaan pompa bertekanan tinggi yang mendorong fase gerak dan sampel melewati fase diam.
Sumber : https://news.labsatu.com/mengenal-hplc-dan-prinsip-kerjanya/
