lihat pertanyaan sebelumnya
Assalamualaikum bapak, izin menjawab pertanyaan diskusi .
1. Apa prinsip dasar ekstraksi DNA ?
Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah menghancurkan dinding dan membran sel tanaman/hewan/mikroorganisme seperti bakteri lalu mengeluarkan DNA yang terdapat dalam nukleus tanpa menyebabkan kerusakan pada DNA tersebut (Sharma et al. 2010). Sementara menurut Chi et al. (2009), secara umum proses ekstraksi DNA dibagi menjadi beberapa tahap yaitu persiapan materi yang akan digunakan, proses penghancuran sel, penghilangan senyawa kontaminan, dan pengumpulan DNA. Menurut Ogunkanmi et al. (2011) DNA yang diekstrak harus terbebas dari senyawa kontaminan seperti polisakarida, polifenol, dan tanin yang seringkali ikut terbawa dan dapat menghambat kerja beberapa enzim dalam kegiatan molekuler. Dalam kegiatan pemuliaan berbasis molekuler, ekstraksi DNA merupakan tahap yang sangat penting dan menentukan tahapan selanjutnya (Fulton et al., 1995). Diperlukan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang memadai untuk kegiatan berbasis molekuler seperti Polymerase Chain Reaction (PCR), Southern blotting, konstruksi pustaka genomik, hingga sekuensing (Ibrahim, 2010). Kehadiran senyawa kontaminan seperti polisakarida dan polifenolyang ikut terekstraksi seringkali menghambat kerja enzim tertentu sehingga harus dihindari (Hoarau et al., 2007). Oleh karena itu dibutuhkan metode ekstraksi yang mampu menghasilkan DNA dengan kuantitas dan kualitas yang baik.
2. Apakah kamu dapat mengekstraksi dari bahan yang ada di sekililing kita ? bagaimana caranya ?
Bisa, misalkan saja kita ingin mengektraksi DNA pada bakteri . maka , langkah yang harus kita lakukan adalah :
· Ekstraksi DNA total dilakukan dengan menggunakan QIAamp® DNA Mini Kit. Koloni tunggal sampel bakteri.
· sampel diletakkan di suhu ruang. 500 µl Buffer AL dimasukkan ke dalam tabung effendorf yang berisi isolat bakteri
kemudian di vortex selama 30 detik.
· Selanjutnya sejumlah sampel diinversi sebanyak 5 kali kemudian masing-masing sampel di vortex kembali selama 30 detik.
· Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang.
· 200 µl ethanol dingin dimasukkan ke dalam sampel kemudian di vortex selama 30 detik.
· Transfer larutan (500-600 µl) ke dalam tube penampung DNA (tube dengan filter). Sentrifuge selama 30 menit pada
kecepatam 8000 rpm.
· Tube penampung DNA beserta supernatan dibuang selanjutnya dimasukkan ke tube penampung DNA baru.
· 500µl buffer AW1 ditambahkan, sentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm.
· Tube penampung DNA diganti baru. 500 µl buffer AW2 ditambahkan, disentrifuge selama 3 menit dengan kecepatan 14000
rpm.
· Supernatan yang tertampung dibuang, kemudian disentrifuge kembali selama 1 menit dengan kecepatan 14000 rpm.
· Tube penampung DNA dibuang dan tube filter dipindahkan ke tabung effendorf dengan penutup.
· 100 µl buffer AE ditambahkan, sentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm.
· Primer universal digunakan yaitu berupa 27 F (5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') dan 1492 R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT
3') (Richard dan Farooq, 2001).
· Teknik PCR dilakukan menggunakan tube mikrofuge 0,5 ml.
· Total volume campuran reaksi adalah 25 µl yang mengandung 0,5 µl primer universal 27 F; 0,5 μl primer 1492 R, 4 μl DNA
template, 12,5 μl My TAQ Hs Red DNA, dan 7,5 μl ddH₂O.
· Amplifikasi PCR dilakukan dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94°C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 94°C
selama 40 detik, annealing pada suhu 55°C selama 40 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit dengan final
ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit dengan jumlah 30 siklus. Hasil amplifikasi akan dibandingkan dengan kontrol
negatif.
· Produk PCR dirunning dalam 1% gel agarosa dengan penambahan Gelred.
· 4 µl produk PCR dimasukkan ke dalam sumuran agarosa.
· Elektroforesis dilakukan selama 40 menit dengan tegangan 100 volt. Pengamatan migrasi DNA dilakukan menggunakan
lampu UV transluminator.
1. Apa yang menjadi bahan genetik : DNA atau protein ?
Jawab : DNA
2. Buktikan penelitian yang mendukungnya
Penelitian Hershey-Chase (Alfred Hershey dan Martha Chase) pada tahun 1952.
Pada percobaan pertama, Hershey dan Chase melabeli DNA bakteriofage (fag) dengan unsur fosfor-32 radioaktif (unsur fosfor ada dalam DNA tetapi tidak ditemukan dalam satu pun asam amino yang menjadi komponen dasar protein). Kemudian fag tersebut diinfeksikan ke bakteri E. coli , lalu menyingkirkan cangkang protein dari sel terinfeksi dengan blender dan sentrifuga. Mereka menemukan bahwa perunut radioaktif tersebut hanya terlihat dalam sel-sel bakteri, dan tidak ditemukan pada cangkang protein pada fage.
Pada percobaan kedua mereka melabeli fag dengan belerang-35
radioaktif (35S) (belerang ditemukan pada asam amino sisteina dan metionina,
tetapi tidak ditemukan dalam DNA). Setelah pemisahan, perunut radioaktif
ditemukan dalam cangkang protein fag, tetapi tidak dalam bakteri terinfeksi.
Ini mengkonfirmasi bahwa bahan genetik yang menginfeksi bakteri adalah DNA. Dan dapat disimpulkan bahwa bahan genetik berupa DNA
Jawaban Diskusi ke 2
1. Apa yang menjadi bahan genetik : DNA atau protein ?
Yang menjadi bahan genetik adalah DNA
2. buktikan penelitian yang mendukungnya yaitu
Percobaan Hershey-Chase percobaan yang dilakukan pada tahun 1952 oleh Alfred Hershey dan Martha Chase, yang mengkonfirmasi bahwa DNA merupakan bahan genetik, yang pertama kali didemonstrasikan oleh Avery, MacLeod dan McCarty. Meskipun DNA telah dikenal oleh para biologiwan sejak 1869, pada saat itu kebanyakan orang menganggap bahwa proteinlah yang membawa informasi dalam pewarisan sifat.
Hershey dan Chase melakukan percobaan mereka pada fag T2, virus yang strukturnya saat itu telah diketahui lewat mikroskop elektron. Fag ini terdiri hanya dari cangkang protein yang berisi bahan genetik. Fag ini menginfeksi bakteri dengan menempel pada membran luar bakteri dan menyuntikkan bahan genetiknya lalu meninggalkan cangkang kosongnya tetap menempel pada permukaan bakteri. Infeksi bahan genetik ini mengakibatkan mesin genetik bakteri tersebut memperbanyak virus.
Pada percobaan pertama, Hershey dan Chase melabeli DNA fag dengan unsur fosfor-32 radioaktif (unsur fosfor ada dalam DNA tetapi tidak ditemukan dalam satu pun asam amino yang menjadi komponen dasar protein). Mereka menginfeksi bakteri E. coli dengan fag tersebut, lalu menyingkirkan cangkang protein dari sel terinfeksi dengan blender dan sentrifuga. Mereka menemukan bahwa perunut radioaktif tersebut hanya terlihat dalam sel-sel bakteri, dan tidak ditemukan pada cangkang protein.
Pada percobaan kedua mereka melabeli fag dengan belerang-35 radioaktif (belerang ditemukan pada asam amino sisteina dan metionina, tetapi tidak ditemukan dalam DNA). Setelah pemisahan, perunut radioaktif ditemukan dalam cangkang protein, tetapi tidak dalam bakteri terinfeksi. Ini mengkonfirmasi bahwa bahan genetik yang menginfeksi bakteri adalah DNA. Sehingga penelitian ini membuktikan bahwa bahan genetik adalah DNA.
1. Apa yang menjadi bahan genetik : DNA atau protein ?
Yang menjadi bahan genetik adalah DNA
2. buktikan penelitian yang mendukungnya yaitu
Percobaan Hershey-Chase percobaan yang dilakukan pada tahun 1952 oleh Alfred Hershey dan Martha Chase, yang mengkonfirmasi bahwa DNA merupakan bahan genetik, yang pertama kali didemonstrasikan oleh Avery, MacLeod dan McCarty. Meskipun DNA telah dikenal oleh para biologiwan sejak 1869, pada saat itu kebanyakan orang menganggap bahwa proteinlah yang membawa informasi dalam pewarisan sifat.
Hershey dan Chase melakukan percobaan mereka pada fag T2, virus yang strukturnya saat itu telah diketahui lewat mikroskop elektron. Fag ini terdiri hanya dari cangkang protein yang berisi bahan genetik. Fag ini menginfeksi bakteri dengan menempel pada membran luar bakteri dan menyuntikkan bahan genetiknya lalu meninggalkan cangkang kosongnya tetap menempel pada permukaan bakteri. Infeksi bahan genetik ini mengakibatkan mesin genetik bakteri tersebut memperbanyak virus.
Pada percobaan pertama, Hershey dan Chase melabeli DNA fag dengan unsur fosfor-32 radioaktif (unsur fosfor ada dalam DNA tetapi tidak ditemukan dalam satu pun asam amino yang menjadi komponen dasar protein). Mereka menginfeksi bakteri E. coli dengan fag tersebut, lalu menyingkirkan cangkang protein dari sel terinfeksi dengan blender dan sentrifuga. Mereka menemukan bahwa perunut radioaktif tersebut hanya terlihat dalam sel-sel bakteri, dan tidak ditemukan pada cangkang protein.
Pada percobaan kedua mereka melabeli fag dengan belerang-35 radioaktif (belerang ditemukan pada asam amino sisteina dan metionina, tetapi tidak ditemukan dalam DNA). Setelah pemisahan, perunut radioaktif ditemukan dalam cangkang protein, tetapi tidak dalam bakteri terinfeksi. Ini mengkonfirmasi bahwa bahan genetik yang menginfeksi bakteri adalah DNA. Sehingga penelitian ini membuktikan bahwa bahan genetik adalah DNA.